藍莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究

時間:2018-12-10來源:寶石皇冠藍莓點擊率:557【 返回 】

藍莓(blueberry), 又稱越橘, 屬杜鵑花科(Ericaceae) 越橘屬(Vaccinium.spp)多年生落葉或常綠灌木。其葉含豐富的黃酮類化合物,它具有廣泛的生物活性[1],最主要的是抗氧化活性。目前國內外主要研究藍莓葉中活性物質的提取和抗癌作用[2,3]。本試驗旨在探討藍莓葉黃酮提取物的抗氧化活性,以尋求新型高效的天然抗氧化劑,提高藍莓的利用價值。

1 材 料 與 方 法1.1 材料將藍莓葉(沈陽農業科技開發院藍莓種植基地提供) 50℃烘干,粉碎后過40 目篩,用80%乙醇按1g:20ml,50℃浸提2h 后抽濾,收集濾液,濃縮,石油醚脫脂,AB-8 大孔樹脂純化,40℃減壓濃縮,真空干燥得到黃色粉末狀藍莓葉黃酮提取物,純度為78.04%[4]。

1.2 試劑無水乙醇(分析純,北京化學試劑公司);鹽酸、氫氧化鈉、六氰合鐵酸鉀(分析純,沈陽化學試劑廠);三氯化鐵、三氯乙酸、水楊酸、硫酸亞鐵(分析純,沈陽沈一精細化學品公司);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、抗壞血酸、鄰苯三酚(分析純,國藥集團化學試劑公司);大豆卵磷脂(生化試劑,北京奧博星生物技術公司);三羥基氨基甲烷(Tris)(分析純,天津市科密歐化學試劑開發中心)過氧化氫(分析純,中外合資上海遠大過氧化物公司)。

1.3 儀器UV-1600 型紫外—可見分光光度計,北京瑞利分析儀器公司。

1.4 方法1.4.1 抗脂質過氧化能力的測定[5]: 分別于樣品管中依次加入1ml 10mg/ml卵磷脂溶液(LLS)、1 ml0.4 mmol/L硫酸亞鐵、1 ml樣品,混勻。避光于37℃水浴60min,加入2 ml 三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-HCl混合液,90℃~100℃水浴15 min,迅速冷卻,以 3000 r/min離心lO min,取上清液在535 nm測吸光度(As)。空白管以1ml重蒸水代替1ml樣品,操作方法同樣品管,可測得空白管的吸光度(Ac),參比管中以1ml重蒸水代替1ml卵磷脂。抗壞血酸為陽性對照。

抑制率(%)=[(Ac-As)/Ac]×100以樣品濃度與抑制率作圖,根據擬合方程求出抑制率為50%所需樣品的濃度,即半抑制濃度IC50。

1.4.2 還原力的測定[6]:取不同濃度的藍莓黃酮溶液2.5 ml于試管中,依次加入2.5 ml 0.2 mo1/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5ml l%六氰合鐵酸鉀溶液(K3Fe(CN)6),于50℃水浴保溫20 min后,快速冷卻, 再加入2.5 ml 10% 三氯乙酸, 以3000r/min 離心lO min,取上清液2.5ml,依次加入2.0 ml蒸餾水,0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液,充分混勻,靜置10 min后,在7O0 nm處測吸光值,吸光值越大表示還原力越強 (以蒸餾水作參比)。

1.4.3 清除超氧陰離子自由基( ?

_2 O )的測定[ 7 ]:

(1)鄰苯三酚自氧化的測定:取4.5 ml pH 8.2的 50 mmol/L Tris-HC1緩沖液,4.2 ml蒸餾水,混勻后在25℃ 恒溫水浴中保溫20 min后,取出后立即加入在25℃ 預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液 O.3 ml(以10 mmol/LHCl配制),空白管用10 mmol/L HCl。每隔O.5 min在320 nm 處測定溶液的吸光度,計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加值。(2)樣品活性測定:在加入鄰苯三酚前,先分別加入不同濃度的黃酮溶液0.9 ml, 蒸餾水3.3 ml,然后按(1)的方法操作,計算清除率:

清除率(%)=[(△A0-△A)/△A0]×100(△A0=鄰苯三酚自氧化速率;△A=加入藍莓黃酮后鄰苯三酚的自氧化速率,單位均為吸光度每分鐘的增加值)以樣品濃度與清除率作圖,根據擬合方程求出清除率為50%所需樣品的濃度,即為IC50。

1.4.4 清除羥自由基(·OH)的測定[7]:利用H2O2與Fe2+反應產生·OH,在體系內加入水楊酸捕捉并產生有色物質,該物質在510 nm 下有最大吸收。

反應體系中含8.8 mmol/L H2O2 1ml,10 mmol/LFeSO4 1ml, 10 mmol/L 水楊酸1 ml,分別加入不同濃度藍莓葉黃酮溶液1 ml。最后加H2O2 啟動反應,37℃反應0.5 h,以蒸餾水作參比,在510 nm下測吸光度。考慮黃酮本身的吸光值,以10mmol/LFeSO41ml, 10 mmol/L 水楊酸1 ml,不同濃度的藍莓葉黃酮溶液1ml 和1ml 蒸餾水作為黃酮的本底值。清除率計算公式:

清除率(%)=[(A0-(A1-A2))/A0]×100其中A0為對照液的吸光度,A1為加入黃酮溶液后的吸光度,A2為不加顯色劑H2O2黃酮溶液的吸光度。抗壞血酸作陽性對照,IC50的計算同1.4.3。

1.5 數據分析采用DPS 統計軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1 藍莓葉黃酮抗脂質過氧化能力(圖1,2)

Fig. 1 The capability of flavonoid of blueberry leaveson inhibiting lipid peroxidation

藍莓葉黃酮對Fe2+引發的卵磷脂脂質體過氧化有明顯的抑制作用,抑制率隨黃酮濃度的增加而增大。當黃酮濃度為50 μg/ml時,抑制率為33.36%,當黃酮的濃度為100 μg/ml時,抑制率達到83.36%,再增加黃酮濃度時,抑制率增長緩慢。

藍莓葉黃酮抗脂質過氧化能力(IC5074.40 μg/m)l明顯優于抗壞血酸(IC504.35mg/ml)。

Fig. 2 The capability of ascorbic acid on inhibitinglipid peroxidation

2.2 藍莓葉黃酮的還原力(圖3)

一般情況下,樣品的還原力與抗氧化活性有明顯相關[8]。在一定濃度范圍內,藍莓葉黃酮還原力隨其濃度的增加而增大 (圖3,P<0.05),低于同濃度抗壞血酸的還原力。

Fig. 3 The reducing abilities of flavonoids of blueberryleaves

2.3 藍莓葉黃酮清除?_2 O 能力(圖4,5)

Fig. 4 The capability of flavonoids of blueberryleaves on scavenging superoxide anion radicals

隨黃酮濃度增加, _2 O 的清除率也隨之提高,IC50 352.29 μg/ml,但低于抗壞血酸對? _2 O 的清除作用IC50 3.29 μg/ml。

隨藍莓葉黃酮濃度增大,對·OH的清除率增強,IC50 342.25 μg/ml,但藍莓葉黃酮對·OH的清除能力不如抗壞血酸(IC50 43.22 μg/ml)。

鐵離子可以誘發脂質體的氧化,但脂質體氧化開始后,衍生出來的過氧化物、自由基,也會造成油脂的連鎖反應,促使油脂氧化,黃酮在鐵離子催化下的抗氧化可能是對鐵離子螯合以及對自由基清除的綜合表現[9]。由于黃酮類結構中大分子間的共軛效應,螯合鐵離子的能力高于抗壞血酸,所以表現出抗脂質過氧化能力高于抗壞血酸。

Fig. 5 The capability of ascorbic acids on scavengingsuperoxide anion radicals

2.4藍莓葉黃酮清除·OH能力(圖6,7)

Fig. 6 The capability of flavonoids of blueberry leaveson scavenging hydroxyl radicals

Fig.7 The capability of ascorbic acids on scavenginghydroxyl radicals


還原力的測定以樣品是否為良好的電子供應體為指標,還原力大的樣品除供應電子使Fe3+還原為Fe2+外,亦可使自由基成為穩定的物質。藍莓葉黃酮的還原力小于抗壞血酸,是因為抗壞血酸存在稀醇式2-OH 互變異構體,還原力能力強。所以藍莓葉黃酮清除_2 O 和·OH 的能力低于抗壞血酸。


關鍵詞:藍莓葉;黃酮;抗氧化Key words:blueberry leaves; flavonoids;antioxidant[參 考 文 獻]

[1] 裴凌鵬,惠伯棣,金宗濂,等.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術研究進展[J].食品科學,2004,25:

203-207.

[2] Skupien K, Oszmianski J, Kostrzewa-Nowak D, etal. In vitro antileukaemic activity of extractsfrom berry leaves against sensitive and multidrugresistant HL60 cells[J]. Cancer letters,2006,236:281-291.

[3] 王作昭,劉靜波,林松毅,等.篤斯越桔黃酮類化合物提取技術的試驗研究[J].食品科學,2006, 27:391-394.

[4] 李穎暢,孟憲軍,李小紅.大孔樹脂純化藍莓葉總黃酮的工藝研究[J].食品與發酵工業,2008,34:133-137.

[5] 張爾賢,俞麗君,周意林,等.Fe2+誘發脂蛋白PUFA過氧化體系及對若干天然產物抗氧化作用的評價[J]. 生物化學與生物物理學報,1996,28:218-292.

[6] 莫開菊,柳圣,程超.生姜的抗氧化活性研究[J].食品科學,2006,27:110-115.

[7] 陳留勇,孟憲軍,賈 薇,等.黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究[J]. 食品科學,2004,25:167-170.

[8] Yen GC, Chen HY. Antioxidant activity of varioustea extracts in reation to their antimutagenicity[J]. J Agric Food Chem,1995,43:27-32.

[9] Ock-Sook Yi. Antioxidant activity of grape extractsin a lecithin liposome system[J]. JAOCS,1997,74:1301-1306.

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